De joven sirvió en el Punyab (India) y exploró el Himalaya. Hizo tres viajes de exploración a África. También fue el creador de la "hipótesis camita", una de las principales causas sospechosas del Genocidio de Ruanda.

En su primer viaje, en 1854, se unió al famoso Richard Francis Burton para una expedición a Somalia. Speke quedó en la ciudad de Barbera a la espera del retorno de Burton, quién, partiendo de Zaila, consiguió llegar, a pesar de las dificultades, a la 'ciudad prohibida' de Harar.

Hizo dos viajes más al África con Richard Francis Burton en busca de las fuentes del río Nilo (1857 y 1858). En el segundo de esos viajes descubrieron el lago Tanganica. Por enfermedad de Burton, Speke continuó hasta que descubrió el lago Victoria, que señaló como origen del Nilo a su regreso a Inglaterra sin esperar el retorno de Burton.

En virtud de una polémica con Burton (que no aceptaba que el lago Victoria fuera la fuente del Nilo), volvió unos años después (en octubre de 1860) para demostrar que sus cálculos eran correctos, y descubrió las cataratas Ripon, que intuyó eran donde nacía el Nilo. Esta vez volvió por el lado norte, aunque no pudo hacerlo siguiendo todo el curso del Nilo por problemas con las tribus vecinas, siguió la dirección norte hasta Gondokoro (Sudán) donde se encontró con Samuel Baker y su esposa que iban río arriba, y terminó de atravesar Egipto para volver a Inglaterra.

La discusión con Burton se originó a raíz de que Burton creía que el Nilo nacía en el lago Tanganica, pero Speke le dijo que no podía ser, porque este lago estaba por debajo del nivel del lago Victoria y que el agua no podía subir, determinó el incremento de nivel, en unos 360 m.¹​ Este cálculo lo basó en la diferencia de la temperatura de ebullición del agua en ambos lugares. Años más tarde Henry Morton Stanley demostró que Speke tenía razón.

Murió con 37 años en un sospechoso accidente de caza en Somerset por un disparo de su propio rifle, la mañana del 18 de septiembre de 1864, día señalado para el enfrentamiento cara a cara con Burton para probar su teoría, organizado por la sección geográfica de la Asociación británica de Bath. Este hecho hizo prevalecer la errónea teoría de Burton ante la opinión pública hasta que Henry Morton Stanley la rebatió en 1877.

• La abreviatura «Speke» se emplea para indicar a John Hanning Speke como autoridad en la descripción y clasificación científica de los vegetales.²​

• Grandes lagos de África
• Richard Francis Burton
• James Augustus Grant
• Samuel White Baker
• Henry Morton Stanley

• «John Hanning Speke». Índice Internacional de Nombres de las Plantas (IPNI). Real Jardín Botánico de Kew, Herbario de la Universidad de Harvard y Herbario nacional Australiano (eds.). 
• Obras de John Hanning Speke en Project Gutenberg.
• Tras las fuentes del Nilo.
•   Wikimedia Commons alberga una galería multimedia sobre John Hanning Speke.